这是最重要的一步.理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些条件
1)x05足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量
2)x05GC% 40%~60%
3)x055'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
4)x05避免3'端GC rich,最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC (有人说：3' 端最好是 GC/CG/CC/GG.)
5)x05避免3'端的互补,否则容易造成DIMER
6)x05避免3'端的错配
7)x05避免内部形成二级结构
8)x05附加序列(RT site,Promoter sequence)加到5'端,在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们
9)x05使用兼并primer时,要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM)
10)x05最好学会使用一种design software.PP5,Oligo6,DNAstar,Vector NTI,Online design et al.