下面是一个论坛中的帖子与回复,希望能够对你有所帮助：|
我取的-20度甘油保存的菌,过夜复苏,然后按1：100扩大摇一段时间之后加IPTG诱导,摇了3小时之后培养物居然变清亮了!我白思不得其解
望高手指点一下!
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你说的培养物变清凉是相对于1%接种后而言的吗?1：100扩大培养后,细菌变得有多浑浊(测定OD600,一般达到0.5-1.0)?如果加入IPTG后细菌生长得很慢属于正常现象,因为IPTG对细胞有毒性,加之有抗性压力,不携带质粒的细胞是不生长的.关于你遇到的情况,我想可能是:
1.工程菌的问题,可能携带的质粒已经丢失,工程菌不具有抗性,建议在诱导前先检测一下质粒稳定性.
2.活化诱导时加入的抗生素过低未加或失效,扩大培养时加入抗生素又过量,建议重新配制抗生素.
3.加入的IPTG浓度过高.
4.培养基的问题,营养不足.
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1.工程菌的问题,可能携带的质粒已经丢失,工程菌不具有抗性,建议在诱导前先检测一下质粒稳定性.
2.活化诱导时加入的抗生素过低未加或失效,扩大培养时加入抗生素又过量,建议重新配制抗生素,这条也比较勉强.
3.加入的IPTG浓度过高.
4.培养基的问题,营养不足.,
5.噬菌体污染,导致菌体降解.可以重新转化新的感受态细胞.
6.对部分重组菌来说,过低的诱导前菌量常导致有毒性的IPTG诱导后菌体崩解.
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1:不加IPTG时怎么样.
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不加IPTG 时很正常.后来我换IPTG重复做了一次,菌摇浑了,但菌量不大.同时我在平皿划线挑单菌落培养,提质粒检测发现有的已经丢失了,有的仍完好.为保险,我重新转化了质粒.现在情况比较正常.
多谢各位战友的指教!
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会不会是噬菌体污染呢?
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我也怀疑过,因为实验室有人在做噬菌体,但是在一个单独的屋子做.而且整个实验室就我一个人遇到这种情况,我想这种可能性比较小.
幸运地是,现在一切良好,进展还算顺利.
愿人人事事进展顺利!
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我也学到了一点,
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To:wangjun2002274 我的意见与您相左：
我也遇到过以上的情况,抗生素我是以50ug/ml加kan的.培养基是LB这不会有什么问题.IPTG诱导之前菌体很浑OD达到0.8左右,加IPTG以后3小时就变清!这个菌种是我4天前复苏的,之后放4度冰箱.但是我后来把菌种重新复苏效果挺好的!包涵体的量也挺好!我的看法是,复苏菌时间不能太长（以6-7小时为宜）,即OD值不能太高.尤其是Bl21菌,因为它繁殖速度是DH5a无法比拟的!菌体太老再加上IPTG的毒性是变清的主要原因.我认为.
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我觉得可能是遭不明微生物污染了,尤其是很快即变清亮的话十有***都是遭噬菌体了.OD值高低应不是问题,我在发酵罐中OD600达10左右才开始诱导都没问题.
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不晓得楼主出现问题的原因是否与此一样：
早上我扩大培养摇了两瓶菌,2个小时浑的很好.加IPTG（不同来源的即我上次出问题的和我借别人的）后,有一瓶（我上次出问题的IPTG）清亮了.我认为是IPTG的原因.为了更确认我用同样的培养基和IPTG又要了两瓶,结果出我意料两瓶都浑得很好.所以我得出以下结论：摇菌的容器有问题!因为最近我们实验室换了一种洗洁净,清洗时未洗净!我们实验室也有人出现类似情况（最近）.我认为残留与IPTG可能形成对细菌有毒的物质,致使菌体死亡,菌液变清!