1、DNA的分子大小及构型
不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular,cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA.线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢.当琼脂糖浓度太高时,环状DNA（一般为球形）不能进入胶中,相对迁移率为0（Rm=0）,而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0）,由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度.
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同.DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系.凝胶浓度的选择取决于 DNA分子的大小.分离小于0.5kb的DNA段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%.
3、DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关.相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢.如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA.
4、电源电压
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好.在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比.但是,在电场强度增加时,不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小.要使大于2kb的DNA段的分辨率达到最大电场强度不宜高于5V/cm.
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％.
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率.在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性.对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温.