首先的确会出现菌液中混杂其他细菌的可能性,一般情况下不同细菌的菌落形态能够区别,划线分离得到的单菌落一般认为是由一个细菌细胞分裂产生的,因此可以分离到纯培养的单一性状的菌株.
其次,细菌实验的操作要求比较高,对于专业人士而言无菌操作是非常规范的,一般染菌的概率不会超过百分之一,因此在操作过程中污染杂菌的可能性非常低,也就是说划线后的平板上不会有通过其他途径污染的菌落出现.
最后,菌液里的个体菌的确可能存在差异,例如杂菌污染,单个个体特征不一样,例如携带质粒的情况,具有某种抗性,具有某种缺陷（营养缺陷等）,携带（温和型）噬菌体或其他转座原件、,菌株存在其他亚型等等情况,因此划线分单菌是非常有效的分离这些细微差异的方法,并挑取分离得到的菌落进行后续实验.