列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理

1个回答

  • 1、经典的半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR.提取总RNA,通过光度计和电泳法检测质量并定量,采用反转录试剂盒进行反转录.对于半定量RT-PCR,采用内标基因(如25SRNA)引物对各样品进行普通PCR扩增和电泳,证明反转录成功,并通过调整加入的总cDNA第一链的量,使各样品间内标扩增条带亮度达到一致.然后以此总cDNA第一链的模板量进行目标基因的普通PCR扩增,电泳后通过条带有无和亮度强弱来比较各样品间(器官组织间、发育阶段间、诱导时间间等)目标基因表达的水平的差异性或变化动态.对于实时荧光定量RT-PCR,反转录完成后,通过内标基因或其它基因的扩增证明反转录成功,然后直接对内标基因和目标基因进行实时荧光定量PCR扩增,通过仪器自动检测Ct值来比较各样品间目标基因表达水平的差异性或动态变化.

    2、芯片杂交法和SAGE法.将各样品的总RNA反转录得到的总cDNA进一步合成为双链总cDNA,用适当的酶切处理,得到小片段,然后与芯片杂交,电脑对不同样品间相同基因的杂交信号强度进行叠加处理,自动分析出各样品间各基因表达水平的表达差异性或变化动态.SAGE (serial analysis of gene expression)是基因表达系列分析,将各样品总cDNA采用适当酶切,得到短片段,然后互相连接成800bp左右的串联体,然后测序,然后采用电脑自动统计各基因被测序到的次数,以此表示各样品内各基因表达的丰度,然后比较各样品间各基因表达水平的差异性或动态变化.