1、平板克隆形成试验
基本步骤：
(1)取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用.
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中.一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀.置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2～3周.
(3)经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养.弃去上清液,用PBS小心浸洗2次.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15分钟.然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥.
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数.最后计算克隆形成率.
克隆数
克隆形成率= —————×100%
接种细胞数
平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大.
2、软琼脂培养克隆形成试验
基本步骤：
(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L.然后根据实验要求作梯度倍数稀释.
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固.
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用.
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层.待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天.
(5)把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数.计算形成率.
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系.试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃.接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞.正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验.