Question

如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码蛋白的基因,并使之在大肠杆菌中表达

Answer 1

一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中 （测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、 纯化、进一步检测. [主要试剂 主要试剂] 主要试剂 1、LB 培养基. 2、 100mM IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2.38g IPTG 溶于100ml ddH2O ： 中,0.22?m 滤膜抽滤,-20℃保存. [操作步骤 操作步骤] 操作步骤 1、通过 PCR 方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因 序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点,本实验中为 BamHⅠ和 HiindⅢ） ,PCR 循环获得所需基因片段. PCR 反应体系为： 模板 （含 R 基因的重组质粒） 上游引物 PR1 下游引物 dNTP（2.5mmol/L） 10×PCR buffer（含 Mg2+） Taq 酶 ddH2O 补至 1?l 1?l 1?l 5?l 10?l 1?l 100?l PCR 反应条件为：94℃变性 3min；94℃变性 3min、52℃复性40sec、72℃ 延伸1min,30个循环；最后72℃延伸8min. 2、构建重组表达载体 （1）载体酶切：将表达质粒 pRSETA 用限制性内切酶（同引物的酶切位点） 进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用凝胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片 段. （2） 基因 PCR 产物双酶切后回收, T4 DNA 连接酶作用下连接入载体. R 在 连接反应体系为： pRSETA R 基因片段 T4 DNA 连接酶（5U/?l） 5×buffer ddH2O 补至 1?l 3?l 1?l 2?l 10?l 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1）将连接产物转化大肠杆菌 DH5α,根据重组载体的标志（抗 Amp）作 筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定. （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作.否则 应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点. （3）以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌 BL21（DE3）的感受态细胞. 4、诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含 Amp50?g/ml）中37℃过夜培 养. 2、按1∶100比例稀释过夜菌,一般将1ml 菌加入到含100mlLB 培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至 OD600≌0.5-0.8（最好0.6,大约需3hr） . 3、 取部分液体作为未诱导的对照组, 余下的加入 IPTG 诱导剂至终浓度1mM 作为实验组,两组继续于37℃、200rpm 震荡培养3hr. 4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s 收获沉淀,用100?l 1%SDS 重悬,混 匀,70℃10min. 5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做 SDS-PAGE 等分析. 6 5500rpm 15min 收集细胞 7溶菌酶破碎细胞 制备过柱上清 8 过柱纯化带组氨酸标签蛋白