解题思路：平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；在数次划线后培养，可以分离由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的子细胞群，这就是菌落．
A、倒平板时，用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，防止空气中的杂菌污染，故A正确；
B、左手将培养皿打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，故B正确；
C、五个区域内划线，而且每次转换划线角度后再进行划线，让菌种来源于上一次划线末端，故C正确；
D、没有让接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，故D错误．
故选：D．
点评：
本题考点： 微生物的分离和培养．
考点点评： 本题考查选修中平板划线操作的相关知识，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力．