质粒DNA是现代生物学实验中常用的载体工具,在基因工程领域应用非常广泛.质粒DNA的提取已成为分子生物学实验中的一种常规方法.在“碱裂解法”[1]的基础上进行优化改进,形成了一系列的质粒DNA提取方法[2],并生产出一系列商品化提取试剂盒[3].用经典“碱裂解法”少量提取质粒能获得高质量的质粒DNA,但在提取过程中,碱裂解不完全或裂解过度、蛋白质污染以及酚氯仿的残留都能影响进一步的分子生物学实验效果.我们研究所在“碱裂解法”的基础上进行了优化、改进,尝试了一种经济实用的改良式质粒DNA提取方法,经反复实践验证,该方法比较稳定、可靠,能获得转染级别的质粒DNA.1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、菌株及培养液 含有绿色荧光蛋白报告基因(enhanced green fluorescence protein,EGFP)真核表达质粒载体pEGFPN1(质粒DNA全长4.9kb)购自Clontech公司；转化菌Ecoli.DH5a由本研究所保存.LB培养液(蛋白胨、酵母提取物、氯化钠).1.1.2 内切酶及细胞转染试剂 内切酶BamHⅠ购自TaKaRa公司；脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司.1.1.3 试剂及配制 ①溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,25mmol/L TrisHCl,10mmol/L EDTA,pH8.0；溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,10g/L SDS；溶液Ⅲ：3mol/L乙酸钾,pH 5.5.②Tris饱和酚/氯仿/异戊醇按24∶24∶1体积比配制成混合液.③异丙醇,70%(体积分数)无水乙醇.④RTE溶液：10mmol/L TrisHCl (pH 8.0),1mmol/L EDTA+0.1g/L RNase A(无DNase).以上试剂均为国产分析纯.1.1.3 国产针式滤器 直径35mm可反复使用针式小滤器及0.22μm滤膜购自华美生物公司.1mL、5mL注射器为BD公司产品.1.2 方法 1.2.1 质粒DNA提取的操作步骤 经典质粒DNA“碱裂解法”小提取方法按照第三版分子克隆指南[1]步骤进行.改良式质粒DNA提取具体方案如下：①取1.5mL菌液,8000g/min离心5min,吸净上清；②240μL 溶液Ⅰ重悬,8000g/min离心5min,吸净上清,重复该步骤1次；③240μL 溶液Ⅱ碱裂解,迅速轻柔翻转6次,静止4-5min；④240μL溶液Ⅲ中和、沉淀,迅速轻柔翻转6次,冰上静止15min,4℃ 12000g/min离心10min；⑤1mL胰岛素注射器吸取上清,尽量减少吸入蛋白质沉淀层(提取多管时可以用5mL注射器吸取)；⑥上清经国产0.22μm针式滤器(图1)过滤入1.5mL Ependorf管内；⑦加入0.7倍体积的异丙醇,混匀,-20℃静置30min,4℃ 12000g/min离心30min,吸净上清；⑧70%(体积分数)乙醇0.5mL洗涤沉淀,4℃ 12000g/min离心10min,重复该步骤1次；⑨吸净上清,室温自然干燥,出现沉淀边缘透明为止；⑩20μL RTE(含0.1g/L RNase A)溶解沉淀,37℃水浴箱孵育1-3h,彻底降解残余RNA.电泳、酶切鉴定及细胞转染.