扩增4kb的基因怎么设计引物要扩增一个4kb左右的

1个回答

博凌科为-为你如果你是直接从DNA中克隆基因的话,设计一对引物,用高保真的Phusion或者Vent酶就可以.NEB的产品很不错. 如果你要从cDNA中克隆的话,考虑到RNA的降解,你不能使用一对引物来克隆.而是设计两对或者多对引物.比如,你你针对序列这几两对引物,前一对引物的下游,和后一对引物的上游,应该设计15个bp的重合.前一对引物的上游和后一对引物的下游则位于整个4kb基因的首位两段. 这样,你用这两对引物先克隆出4kb基因的两个短片段.然后将两个短片段作为模板,以前一对引物的上游引物,和下一对引物的下游引物来在一个PCR反应体系中扩增,获得4kb的全片段.、如果你要设计多对引物,方法类似,都是上一段的下游和下一段的上游有十几个bp的重合--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------补充一下,如果你是从基因组中直接克隆的话,那就是设计一对引物.使用高保真的聚合酶做long PCR, 目前的Phusion Taq酶对于4kb的片段是没什么问题的.我自己曾经尝试克隆过3kb的片段,非常的清晰,没有任何拖带.但是成功的关键在于你要设计特异性的引物,建议你设计30-50个bp左右的引物（引物越长,对模板的特异性要求越高）,提高退火温度,来保证引物的特异性. 此外,加长PCR程序中的变性时间,来保证基因组DNA的完全接连,适度延长退火时间,加大引物使用的量,来保证引物和模板的结合.毕竟你是从整个基因组中寻找你的目的基因.

1个回答

相关问题