解题思路：耐冷菌参与代谢的酶在低温下仍具有较高的催化活性；耐冷菌适宜生活在寒冷地区；探究耐冷菌的适宜温度，自变量为温度，并保持单一变量原则；使用过的培养基必须经过灭菌处理后再丢弃，经消毒可能还会存在细菌的芽孢．
A、由于耐冷菌生活在低温环境中，因此机体内部的酶在低温下有较高的活性，A正确；
B、北方寒冷环境中生活的耐冷菌较多，容易分离，故B正确；
C、探究耐冷菌生活的最适温度时，自变量为温度，其他变量为无关变量，保证相同且为适宜条件下，C正确；
D、使用过的培养基必须经过灭菌处理后再丢弃，经消毒可能还会存在细菌的芽孢，D错误．
故选：D．
点评：
本题考点： 微生物的分离和培养．
考点点评： 本题考查微生物的利用等知识，意在考察考生对所学生物学知识的理解能力和综合分析能力．