为了表明HAX-1 的降解是凋亡过程的一部分以及OMI可能的参与,我们用ucf-101抑制剂.ucf-101是此前报道过的(13)卵母细胞成熟抑制因子蛋白酶解活性的一种特异性抑制剂.当HK-2 细胞在ucf-101的存在下用顺铂处理时,凋亡细胞百分比下降,而且这种抑制剂明显阻止了HAX-1的降解.当抑制剂浓度加大时这种效应更加突出.
为了证实这种抑制剂在本系统中的特异性,并排除其他蛋白酶而不是OMI 涉及HAX-1酶切的可能性,我们使用mnd2 小鼠衍生的细胞系(9).小鼠胚胎成纤母细胞系(mnd2-MSCV)没有可检测的OMI 蛋白酶活性(9).相同的细胞系被转染到野生型人类OMI的cDNA (mnd2-MSCV-卵母细胞成熟抑制因子) 中,表达了大量的活性OMI蛋白(14).我们发现mnd2-MSCV细胞用各种刺激剂诱导凋亡时,凋亡细胞的数量非常低.进一步讲,没有观察到可检测的HAX-1酶切.这和细胞凋亡很旺盛的mnd2-MSCV-OMI细胞相反,并且HAX-1含量和细胞凋亡水平呈反比关系.该试验清楚地表明了卵母细胞成熟抑制因子单独决定HAX-1的酶切,在本实验使用的条件下对于细胞凋亡是必须的.HAX-1的亚细胞位置取决于细胞形状(21,30),并且已经有报道说可以存在于线粒体、细胞质或质膜 (10、21、22、30)中.我们对细胞亚组分进行了分离操作来研究OMI酶切HAX-1 蛋白的位点.我们发现HEK293 细胞中的HAX-1蛋白主要存在于线粒体,并且这个位点不随刺激剂反应的改变而变化.这暗示着卵母细胞成熟抑制因子靠酶切HAX-1 蛋白来启动线粒体中的细胞凋亡.这和最近的研究是一致的,该研究表明卵母细胞成熟抑制因子能诱导用TNF处理的人类神经多肽的凋亡而不从线粒体中释放出来(7).尽管几个研究清楚地把HAX-1界定为一种抗凋亡蛋白,它发挥功能的机理仍然未知.HAX-1 和Bcl-2蛋白家族有序列相似性 (10,22).