抗体的纯化 ( 硫酸铵沉淀法）
一,基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质.用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法.高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来.各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质.这种方法称之为盐析.盐浓度通常用饱和度来表示.硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广.
二,试剂及仪器
1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等
2.硫酸铵（ NH 4 ） SO 4
3.饱和硫酸铵溶液（ SAS ）
4.蒸馏水
5.PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )
6.透析袋
7.超速离心机
8.pH 计
9.磁力搅拌器
三,操作步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀.各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同.通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% .
（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）
1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中.用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 .此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L,25 ° C ）.
2.其它不同饱和度铵溶液的配制
（二）沉淀
1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片；
2.保留上清液并测量体积；
3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中,终浓度为 1 ：1 （
4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ）,使蛋白质充分沉淀.
（三）透析
1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）.弃上清保留沉淀；
2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中.沉淀溶解后放入透析袋对
PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ）,每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨；
3.透析液离心,测定上清液中蛋白质含量.
四,应用提示
（一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白.
1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中,使浓度为 0.5:1 (v/v) ；
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）,保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到沉淀.将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨；
4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀.将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨；
5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效
（二）为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表 1 ）；硫酸氨沉淀法与层析 技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体.