线粒体由内外两层膜封闭,包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔.
1、外膜 含40%的脂类和60%的蛋白质,具有孔蛋白（porin）构成的亲水通道,允许分子量为5KD以下的分子通过,1KD以下的分子可自由通过.标志酶为单胺氧化酶.
2、内膜 含100种以上的多肽,蛋白质和脂类的比例高于3:1.心磷脂含量高（达20%）、缺乏胆固醇,类似于细菌.通透性很低,仅允许不带电荷的小分子物质通过,大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统.如：丙酮酸和焦磷酸是利用H+梯度协同运输.线粒体氧化磷酸化的电子传递链位于内膜,因此从能量转换角度来说,内膜起主要的作用.内膜的标志酶为细胞色素C氧化酶.
3、膜间隙 是内外膜之间的腔隙,延伸至嵴的轴心部,腔隙宽约6-8nm.由于外膜具有大量亲水孔道与细胞质相通,因此膜间隙的pH值与细胞质的相似.标志酶为腺苷酸激酶.
4、基质 为内膜和嵴包围的空间.除糖酵解在细胞质中进行外,其他的生物氧化过程都在线粒体中进行.催化三羧酸循环,脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中,其标志酶为苹果酸脱氢酶.基质具有一套完整的转录和翻译体系.包括线粒体DNA（mtDNA）,70S型核糖体,tRNAs 、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等.基质中还含有纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质,内含Ca2+、Mg2+、Zn2+等离子