而且用的还是hotstar,理论上应该没问题.我的指导老师也做同样的,是百分之百出来,可以他也找不到我的问题.大家能帮我想想是什么问题吗.问题可能是在我的操作上,但自己实在想不出来,如此之不稳定,实在让人急,求助各位了.也有可能是引物的问题,母液是一样的,但是自己稀释,难道这么不稳定吗,做过一次就降解拉,晕.这种情况我在刚做的时候也有过,主要是作的时候没留心,比如ＰＣＲ时加rTaq时量很少,一不小心就可能没加进去,就作不出来了,或者少加一样这都有可能．所以作的时候一定要小心．不会啊,我很小心了,应该不会少加什么的,因为都是固定的量,急,这个太浪费了我也是有这个问题,同一体系的,一次60个,在PCR仪上跑,就模板不一样,但是就是有>4/5的标本居然连二聚体都是没有的.而且是有时前12个都有后面什么都没有的.只有第一次的时候是30个的基本都有二聚体.PCR的不稳定也许就在它也是有生命的,只有用心做了,才能有效－是不很唯心啊呵呵,肯定是有地方没注意引起的把,狠想找到原因.是啊,刚刚又做个10个,又是什么都没有,依样画葫芦都出不来,液太衰了,还是请大家帮忙找找原因吧你做阳性对照了么?如果阳性对照没出可能酶的问题,你可以换个酶试试.GOOD LUCK你的指导老师也是用的同样的试剂和反应体系吗?如果是的话问题应该出现在操作上.PCR反应体系中的个物质用量都很少,你加完试剂后有没有短暂离心或是振荡过?有时候试剂都残留 在管壁上.还有,你使用的EP管是薄壁的还是厚壁的,这也有影响的.也有可能是加样的枪不准,你可以留意一下wuminwenke wrote:你的指导老师也是用的同样的试剂和反应体系吗?如果是的话问题应该出现在操作上.PCR反应体系中的个物质用量都很少,你加完试剂后有没有短暂离心或是振荡过?有时候试剂都残留 在管壁上.还有,你使用的EP管是薄壁的还是厚壁的,这也有影响的.
1,在做得效果不是很好的情况下,你每次最好少做几个,这样犯错误就小点.
2,加样时最好贴壁加,因为每个东西都那么少,很容易顺着枪头带点出来.稍微多或少点就把比例改变了,影响实验结果.同样取样时也要注意.
3,离心是很有必要的,因为有许多试剂贴在壁上,稍微用离心机短暂离心一下,这样就不至于残留在壁上了.
你在加样注意下,我相信你会得出很好结果的.祝实验顺利!可能是手法问题：你可以先配混合液,均匀混合后小量分装进行PCR扩增,可以保证平行性；混匀要充分缓慢；整个操作过程可以在冰上进行.
你试一下吧,祝好谢谢各位啊,我用的热启动PCR,所以不用在冰上进行（hotstar贵啊,汗）.另外,确实是先混合,再分装,最后加模板的,所以我想你们说的问题我都没有,不知是怎么回事,郁闷你可以每加一样东西都把它吹打几下,特别是在加酶,加模板,最后离心一下.加5%的DMSO试试.xiaopingvip wrote:谢谢各位啊,我用的热启动PCR,所以不用在冰上进行（hotstar贵啊,汗）.另外,确实是先混合,再分装,最后加模板的,所以我想你们说的问题我都没有,不知是怎么回事,郁闷
最好还是在冰上,做实验严谨些,除了hotstar之外,其他的试剂在加样前和加样后也应在冰上保存啊.