亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的,合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的,相邻的核苷酸通过 3' → 5' 磷酸二酯键连接,具体反应步骤如下：
第一步：将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- 羟基. 第二步：亚磷酰胺保护的核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的 3' 端被活化,与 CPG 载体上连接碱基的 5'- 羟基发生缩合反应. 第三步：带帽 (capping) 反应,缩合反应中会有少量 5'- 羟基没有参加反应,用乙酸酐和 1- 甲基咪唑封闭 5'- 羟基,使其不能再继续发生反应,这种短片段在纯化时可以分离去除. 第四步：在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯. 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上.再以三氯乙酸脱去它的 5'- 羟基上的保护基团 DMT ,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去.