【毛细管电泳】是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法.
【所用设备】主要部件有0～30kV可调稳压稳流电源,内径小于100μm(常用50～75μm)、长度一般为30～100cm的弹性石英毛细管、电极槽、检测器和进样装置.检测器有紫外／可见分光检测器、激光诱导荧光检测器和电化学检测器,前者最为常用.进样方法有电动法(电迁移)、压力法(正压力、负压力)和虹吸法.成套仪器还配有自动冲洗、自动进样、温度控制、数据采集和处理等部件.
毛细管电泳所用的石英毛细管柱,在pH值＞3的情况下,其内表面带负电,与缓冲液接触时形成双电层,在高压电场作用下,形成双电层一侧的缓冲液由于带正电而向负极方向移动,从而形成电渗流.同时,在缓冲溶液中,带电粒子在电场作用下,以各自不同速度向其所带电荷极性相反方向移动,形成电泳.带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和.各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离.
目前,毛细管电泳的分离模式有以下几种.
(1)毛细管区带电泳,用以分析带电溶质.为了降低电渗流和吸附现象,可将毛细管内壁涂层.
(2)毛细管凝胶电泳,在毛细管中装入单体,引发聚合形成凝胶,主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物.另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质,如葡聚糖、聚环氧乙烷,装人毛细管中进行分析,称毛细管无胶筛分电泳,故有时将此种模式总称为毛细管筛分电泳,下分为凝胶和无胶筛分两类.
(3)胶束电动毛细管色谱,在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠,形成胶束,被分离物质在水相和胶束相(准固定相)之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移,达到分离.本模式能用于中性物质的分离.
(4)亲和毛细管电泳,在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基,以亲和力的不同达到分离目的.
(5)毛细管电色谱,是将HPLC的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程,此模式兼具电泳和液相色谱的分离机制.
(6)毛细管等电聚焦电泳,是通过内壁涂层使电渗流减到最小,再将样品和两性电解质混合进样,两个电极槽中分别为酸和碱,加高电压后,在毛细管内建立了pH梯度,溶质在毛细管中迁移至各自的等电点,形成明显区带,聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器.
(7)毛细管等速电泳,采用先导电解质和后继电解质,使溶质按其电泳倘度不同得以分离.
以上各模式以(1)、(2)、(3)种应用较多.
电极槽和毛细管内的溶液为缓冲液,可以加入有机溶剂作为改性剂,以及加入表面活性剂,称作运行缓冲液.运行缓冲液使用前应脱气.电泳谱中各成分的出峰时间称迁移时间.胶束电动毛细管色谱中的胶束相当于液相色谱的固定相,但它在毛细管内随电渗流迁移,故容量因子为无穷大的成分最终也随胶束流出.其他各种参数都与液相色谱所用的相同.
一、对仪器的一般要求
所用的仪器为毛细管电泳仪.正文中凡采用毛细管电泳法测定的品种,其所规定的测定参数,除分析模式、检测方法(如紫外光吸收或荧光检测器的波长、电化学检测器的印加电位等)应按照该品种项下的规定外,其他参数如毛细管内径、长度、缓冲液的pH值、浓度、改性剂添加量、运行电压或电流的大小、运行的时间长短、毛细管的温度等,均可参考该品种项下规定的数据,根据所用仪器的条件和预试验的结果,进行必要的调整.
二、系统适用性试验
同高效液相色谱法项下,按各品种项下的要求,进行预试验,并调节各运行参数使达到规定指标,方可正式测定.
三、测定法
同高效液相色谱法项下.目前毛细管电泳仪的进样精度较高效液相色谱法低,定量分析时以用内标法为宜.