分子生物学方面的问题-----关于lac启动子 :)

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  • Lac启动子:它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成.Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控.正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子,促使转录进行.负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录.乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生.在讲些相关知识:

    启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列.没有启动子,基因就不能转录.由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子.

    原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要.在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区.来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化.在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区.转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子.-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链.

    原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等.

    启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列.没有启动子,基因就不能转录.由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子.

    原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要.在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区.来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化.在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区.转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子.-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链.

    原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等.

    SD序列

    1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列.这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点.以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列.它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译.另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后,才能产生一个完整的蛋白质.

    终止子

    在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator).转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来.对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点,即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C富含区域又具有回文对称结构.这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构,并且有与A/T富含区对应的一串U.转录终止的机制较为复杂,并且结论尚不统一.但在构建表达载体时,为了稳定载体系统,防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性,一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子.

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