自然界的微生物,几乎都是混杂在一起的.人们要想观察、研究和利用某一种微生物,就必须将它从各种微生物混生的环境中分离开来.所以微生物的分离是一项十分重要的技术.
一、分离的基本方法
微生物分离的方法很多,主要有连续稀释分离法,平板划线分离法和单细胞分离法等方法.其中,单细胞分离法需要贵重精密仪器,中学无法开展,而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行,中学完全具备开展条件.现将这两种方法说明如下.
1.连续稀释分离法
①取1克土样,在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内,充分摇匀,将菌分散.
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升,放入盛有9毫升无菌水的试管中,并进一步稀释成1000倍,即10-3的菌悬液.按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释,都须更换移液管）.
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液,分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内,同一稀释液重复做3个培养皿.
④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内,轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀,凝固后,将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右）,每天观察培养基表面有无微生物菌落.
⑤经过一定时间培养后,培养基上长出菌落,根据菌落特征,初步判断属于何种类型的微生物,并在显微镜下检查,若菌体形态一致,则可认为是初步分离到纯菌种.
⑥将分离培养所得的纯菌种,从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养.
2.平板划线分离法
①取1克土样,在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中,堵塞棉塞,制成菌悬液待用.
②取一培养皿置于实验台上,左手将培养皿打开稍许,向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升,轻轻转动培养皿,使其中的培养基分布均匀,平放桌上,使其凝成平板.然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区.应连续制作几份平板培养基.
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开.在此同时,用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液,迅速送入培养皿内,在平板培养基的一边,作第1次平行划线 6～7条,转动培养皿约70°角,用烧过冷却的接种针,通过第1次划线部分作第2次平行划线,然后再用同样方法,作第3次平行划线.划线时,应使平板培养基表面向下,以免空气中杂菌落入.接种针应与平板表面成30°角左右.不要使接种针碰到培养皿边缘,也不要将培养基划破.
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养,待长出菌落后,鉴定微生物类群,并根据镜检结果,判断是否已分离到了纯菌种.如果菌种很纯,则可转移到斜面培养基上进一步培养.
连续稀释分离法和平板划线法,均须在无菌室或接种箱内进行.
二、各类微生物的分离
1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌
其分离方法见本节“分离的基本方法”
2.从土壤中分离放线菌
①制作高氏一号培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用.
②称取土壤10克,放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中,并加入10%酚10滴,以抑制细菌生长.振荡10分钟,制成10-1菌悬液.按照连续稀释分离法,进一步制成10-3菌悬液.
③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液,注入平板培养基上,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上.然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中,培养7～10天,培养基上会出现微生物菌落.如果菌落的硬度较大,干燥致密,且与基质紧密结合,不易被针挑起,这就是放线菌菌落.
④挑取放线菌菌落,接种于斜面培养基上.
3.从土壤中分离霉菌
①制作豆芽汗葡萄糖培养基,并添加80%乳酸数滴,以抑制细菌生长.将培养皿中,凝成平板,待用.
②称取10克土壤,按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液.
③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上,用玻璃刮刀涂抹均匀.然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天.培养基上会出现微生物菌落.霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状,可根据这一特征寻找霉菌菌落.
④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上.
4.从饮水中分离大肠杆菌
①制作伊红美蓝培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用.
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水,按1：10稀释.
③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上.用平板划线分离法进行分离.
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时.培养基中会出现大肠杆菌菌落,菌落中心呈暗蓝黑色,发金属光泽.
⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）.