如果你确认 “转化后挑取含有目的片段的单菌落”这个步骤正确的话,就是你的PCR出问题了么,继续扩增便可.
目的片段与载体脱离还是保留的菌种失活? 应该都不会.我认为你的PCR体系除了问题,换一组酶和buffer,提一下模板,重做吧,会出来的.