解题思路：平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；在数次划线后培养，可以分离由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的子细胞群为菌落．转换划线角度后要对接种环进行灼烧灭菌再进行划线；等待平板冷却凝固后需要倒过来放置，目的是防止培养皿内壁上出现的冷凝水污染培养基．
A、使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中还需灭菌，因为接种环会感染细菌，故A错误．
B、打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后还需通过火焰灭菌，再塞上棉塞；故B错误．
C、将沾有菌种的接种环迅速伸人平板内，划三至五条平行线，还需盖上培养皿盖，防止空气中杂菌混入，故C错误．
D、最后将平板倒置，防止盖子水滴落引起污染，有利培养基水蒸发；故D正确．
故选D．
点评：
本题考点： 微生物的分离和培养．
考点点评： 本题考查平板划线操作的相关知识，意在考查学生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识的网络结构．