1 越靠两头越好,因为靠近两头扩增的两个片段就短,将来测序的时候花钱少,但前提是你得保证引物的TM值和RACE配套引物的TM值接近,还有引物的GC含量别太离谱
2 可以分开设计,但是5‘race 我们自己设计的引物时下游引物,应和已知序列模版片段反向互补,3’race我们设计的是上游引物和已知序列模版片段相同
3 设计原则（说明书提供）：
（1）引物长度以20-28 nt为宜.
（2）引物中的GC含量一般为45%-55％,GC、AT分布均匀,应尽量避免局部富含GC或AT.
（3）引物最好不形成二级结构（发夹结构等）,与5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer不能形成复杂结构.
（4） 引物3′端的3～4个碱基不要与配对引物形成互补序列.
我个人比较看重自设引物的TM值和RACE引物的TM值是否接近,GC含量别太离谱就行,其他基本不考虑
4 一般5‘Race的自设下游引物是两个,其中一条在另一条的上游相距几个碱基（自己掌握）,用于巢式PCR,就是用RACE自带的上游引物和那个你自己设计的靠下游的下游引物进行第一轮PCR,再用PCR产物做模板以RACE自带的上游引物和那个你自己设计的靠上游的下游引物进行第二轮PCR,这样扩增的结果比较可靠,如果第二轮P不出来,说明第一轮P的产物可能存在问题,即可能是失败的.如果你资金比较充足,老板比较大方,可以多设几条以防不测