浓缩胶的作用原理
不连续缓冲系统的主要优点之一是可以使用稀样品.这是因为在样品进入分离胶以前,先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被 浓缩至一极窄的区带.其作用原理是在缓冲系统中的弱酸,如甘氨酸,在接近其pKa的pH值时,任何时候都只有一部分分子带负电.如样品和浓缩胶均用pH 6.7的Tris-HCI缓冲液,电极液用Tris-甘氨酸缓冲液.此时,甘氨酸很少解离,其有效泳动率很低,而氯离子却有很高的泳动率,蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间.一旦加上电压,作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来,并在其后面留下一个导电性较低的区带.由于导电性与电场强度成反比,这一区带便获得较高的电压梯度,并加速甘氨酸的泳动,使其赶上氯离子, 建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态,使这些带电颗粒以相同速度泳动,两种离子之间具有明显的边界.当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时,在移动界面前有一低电压梯度,在界面后有一高电压梯度.由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低,因此氯离子能迅速越过.移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中,其泳动速度比甘氨酸快.因此,移动的界面将蛋白质分子堆积到一起,浓缩为一狭窄的区带.蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶中的Tris-HCI的浓度,而与样品中蛋白质的最初浓度无关.由于浓缩胶为大孔凝胶,故对样品没有分子筛作用.当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时,凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离.此时甘氨酸的有效泳动率增加,使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动.同时由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小.于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动,并根据其固有的带电性和分子大小进行分离.