解题思路：基因表达载体的构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用．基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因．
A、基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶的协助，A正确；
B、基因工程的操作中基因表达载体构建是在体外条件下进行的，B错误；
C、抗生素抗性基因或荧光标记基因可作为标记基因，便于目的基因的筛选，C正确；
D、基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因，其中启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的末端，D正确．
故选：B．
点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．
考点点评： 本题考查了基因表达载体构建的相关知识，意在考查学生的识记和理解能力，属于中档题．