限制性内切酶只能识别并切割特异的双链DNA序列,这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列,也就是在切割部位,一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致.我们在说一个限制性内切酶例如EcoRⅠ的酶切位点时,只是为了方便只提GAATTC,但此处的GAATTC是包含双链信息的（另一条链5'到3'的序列也是GAATTC）.两边加接头碱基并不影响酶的识别特异性.
总之,一般来说,限制性内切酶不能切割DNA单链,除非单链内部形成了局部的回文结构（可以认做某种意义上的双链）恰好是限制性内切酶的切点.