2.毕赤酵母的开发利用
Koichi Ogata等人于1969年首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长(Ogata,et a1.1969 ),此后,用甲醇利用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注.1987年,Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg随后Philip Petroleum公司与Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就开始了毕赤酵母表达系统的合作开发.SIBIA.的研究人员分离了AOX基因的启动子和宿主菌株,构建了载体,并开发出了相应的毕赤酵母基因操作技术,结合Philip Petroleum公司生产单细胞蛋白的发酵工艺,实现了外源蛋白的高效表达.1993年,Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给Research Corporation Technologies公司,并委托Invitrogea公司进行有关产品销售.
2.毕赤酵母利用的优缺点分析：
Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达.包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等.表达载体都是穿梭质粒,先在大肠杆菌复制扩增,然后被导入宿主酵母细胞.为使产物分泌胞外,表达载体还需带有信号肽序列.
甲醇营养型毕赤酵母优点：
(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子,这是目前最强,调控机理最严格的启动子之一；
(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化；
(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；
(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；
(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染.
甲醇营养型毕赤酵不足之处：
(1)发酵周期长
(2)甲醇易燃易爆有毒,存在一定的危险性
(3)筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵
(4)培养基和培养条件不成熟毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程一般包括3个阶段:(1)细胞增殖阶段(2)分批流加的过渡阶段(3)诱导表达阶段（甲醇）各阶段碳源都为限制性基质,其补加速率的动力学模型是高效表达的基础.
毕赤酵母表达常用载体：
典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1）,它们被多克隆位点（MCS）分开,外源基因可以在此插入.此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区.当整合型载体转化受体时,它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上,外源基因在5'AOX1启动子控制下表达.毕赤酵母本身不分泌内源蛋白,而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列.而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌.分泌表达载体主要有：pPIC9,pPIC9K,pHIL-S1,pPICZα A,pYAM75P等.胞内表达载体主要有：pHIL-D2,pA0815,pPIC3K,pPICZ,pHWO10,pGAPZ,pGAPZa(Invitrogen),pPIC3.5K等.工程菌株Y11430,MG1003,GS115 （AOX1）,KM71,SMD1168.毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种,都具有HIS4营养缺陷标记.其中,GS115茵株具有AOX1基因,是Mut＋,即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入,表型为Muts,即甲醇利用缓慢型,两种菌株都适用于一般的酵母转化方法.多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同,整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化.含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多.体内整合可通过高遗传霉素抗性,筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入.多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选.得到产量高的表达菌株.另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中,而后再通过交换整合到受体染色体上.表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性,所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白,分泌型表达的蛋白有利于纯化,可用硫酸铵沉淀,然后用离子交换,凝胶过滤层析,疏水层析等方法进一步纯化.具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择.