初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染.经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌.
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的.实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色.碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力.当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的.革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色.革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色.